熒光顯微鏡原理及應用方法

　　落射光激發的熒光法(incident-loght flu放大鏡orescence Epi-FL)　簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術中新發展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品，從樣品上被激發的熒光經物鏡成像並穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。

　　熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品，只要樣品中含有可產生熒光的成分，它便吸收短波的激發光而釋放出波長較長的熒光。不同物質只能吸改特定波長的激發光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發後能發出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質吸收激發光後放出特有熒光的方法稱為自發熒光法。某些物質自身不會吸收激發光，或吸收後不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能顯微鏡吸收特定的激發光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用於醫學、生物學及工業的特異性研究和鑒別上。

　　調整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調整的方法大致相同。

　　① 汞燈的安裝

　　a。 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側或右側；

　　b。 把汞燈的上電極引張安裝並固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中並固定；

　　c。 鎖緊散熱片上的螺絲後，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源後部專用的插座上。

　　d。 詳細的安裝方法請參照有關說明書。

　　② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調整：

　　a。 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min；

　　b。 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的牆上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線；

　　c。 轉動燈室調焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影於牆上；

　　d。 分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔，把汞弧的像其反射像調成並排且盡量*近，但不要重疊在一起。望遠鏡

　　③ 汞燈汞弧在顯微鏡內位置的檢驗：

　　a。 將汞燈照明光路系統中的視場光闌開到最大；

　　b。 把熒光濾光片組推到藍光激發的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼；

　　c。 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物台上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；

　　d。 取下一個物天文望遠鏡鏡，使激發的藍光經物鏡轉換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍色的圓形照明區域，汞弧的像及其反射像都應該出現在這區域的中央部位，否則，可調節燈室金相顯微鏡調焦旋鈕至最清晰，然後分別調節燈室外殼上的5個調節螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像並排在照明區域的中央位置。

　　e。 調好之後，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發後發射出的黃綠色熒光；

　　f。 仔細調焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節隱約可見而很容易調焦清晰。

　　④ 汞燈使用注意事項　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內通有一對鎢電極和液態汞(室溫下附在管壁上)，未點燃時，管內氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發點燃後，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產生強光，溫度升高，管內氣壓迅速升到10個大氣壓。由於是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。

　　a。 汞燈接通電源後需要10-15min預熱時間，汞才能充分汽化並形成汞弧，產生高亮度而穩定的激發光。因此，觀察前要提早通電；

　　b。 汞燈在使用過程中，不要隨意開關汞燈的電源；

　　c。 關掉汞燈電源後，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻後才可再次接通電源，違反這一操作規定時，將會造成嚴重後果！

　　由於汞燈內的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內形成強大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實驗室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內的集光-聚光部件。

　　d。 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當可達600h，使用壽命與開關的次數成反比，應集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴，應珍惜使用。

　　e。 汞燈壽命終結的標志是點燃困難，燈管發黑。